Search for new transport systems across the chloroplast envelope.
Characterisation of new hydrophobic proteins
Recherche de nouveaux systèmes de transport à travers l'enveloppe du chloroplaste. Caractérisation de nouvelles protéines hydrophobes.
Résumé
The chloroplast is an organelle totally integrated in the metabolism of the plant cell. It contains its own metabolic pathways like photosynthesis, aminoacid synthesis. The chloroplast is limited by the envelope composed of two membranes and an intermembrane space. Envelope membranes are the site of transport of metabolites, ions, proteins and information between the plastid and the cytosol. Then, they contain many transport systems, but only some of them have been characterised. Hydrophobicity and low representation are the main limitations for the study of these proteins. In order to characterised new transport systems, we have developed an approach that allowed us to identify new proteins.
This approach is based of the hydrophobicity of translocators that allows solubilisation of these proteins in organic solvents. Hydrophobic proteins were differentially extracted in various mixture of chloroform/methanol according to their hydrophobicity. Then, proteins were separated by SDS-PAGE and analysed by microsequencing. Several new proteins were identified including IE16 and IE18, localized in the inner membrane of the chloroplast envelope.
Functional characterisation of these proteins was continued by analysing sequences homologies with proteins of known function. We have also obtained mutants of cyanobacteria and Arabidopsis thaliana in which genes coding for IE16 and IE18 are disrupted. The analysis of their phenotypes provide informations on the function of these proteins. In particular, IE18 could be involved in the transport of K+ and/or H+. In addition, these proteins have been expressed in heterologous systems. They are produced in the system baculovirus/insect cells. Their biochemical and electrophysiological characterisation are currently in progress.
One of the proteins extracted in organic solvent was demonstrated to correspond to a 35 kDa annexin. The binding of annexin to chloroplasts and its function were studied. This annexin copurifies with chloroplasts and envelope membranes in the presence of calcium. The sulfolipid, a chloroplast specific lipid, is a high affinity site for interaction with annexin. This protein does not form an ionic channel when integrated in lipidic planar bilayers. This annexin does not possess a peroxydase activity. The signification of the interaction of annexin with the chloroplast envelope remains to be determined.
We have developed an approach that can be used systematically for studying transport in various membranes systems.
This approach is based of the hydrophobicity of translocators that allows solubilisation of these proteins in organic solvents. Hydrophobic proteins were differentially extracted in various mixture of chloroform/methanol according to their hydrophobicity. Then, proteins were separated by SDS-PAGE and analysed by microsequencing. Several new proteins were identified including IE16 and IE18, localized in the inner membrane of the chloroplast envelope.
Functional characterisation of these proteins was continued by analysing sequences homologies with proteins of known function. We have also obtained mutants of cyanobacteria and Arabidopsis thaliana in which genes coding for IE16 and IE18 are disrupted. The analysis of their phenotypes provide informations on the function of these proteins. In particular, IE18 could be involved in the transport of K+ and/or H+. In addition, these proteins have been expressed in heterologous systems. They are produced in the system baculovirus/insect cells. Their biochemical and electrophysiological characterisation are currently in progress.
One of the proteins extracted in organic solvent was demonstrated to correspond to a 35 kDa annexin. The binding of annexin to chloroplasts and its function were studied. This annexin copurifies with chloroplasts and envelope membranes in the presence of calcium. The sulfolipid, a chloroplast specific lipid, is a high affinity site for interaction with annexin. This protein does not form an ionic channel when integrated in lipidic planar bilayers. This annexin does not possess a peroxydase activity. The signification of the interaction of annexin with the chloroplast envelope remains to be determined.
We have developed an approach that can be used systematically for studying transport in various membranes systems.
Le chloroplaste est un organite totalement intégré dans le métabolisme de la cellule végétale. Il possède des voies métaboliques qui lui sont propres comme la photosynthèse, la synthèse d'acides gras, la synthèse d'acides aminés. Le chloroplaste est limité par l'enveloppe, constituée de deux membranes distinctes et d'un espace intermembranaire. Par sa localisation, l'enveloppe du chloroplaste constitue un site privilégié de transport de métabolites, d'ions, de protéines et d'informations entre le stroma du chloroplaste et le cytosol de la cellule végétale. Ainsi, l'enveloppe doit renfermer de nombreux systèmes de transport permettant ces échanges. Malgré l'importance de ces transporteurs, très peu d'entre eux ont été totalement caractérisés. La limitation principale provient de la très faible représentation de ces protéines et de leur hydrophobicité. Afin de caractériser de nouveaux systèmes de transport, nous avons développé une nouvelle approche qui nous a permis d'identifier de nouvelles protéines. Nous avons ensuite poursuivi la caractérisation fonctionnelle de ces protéines.
L'approche que nous avons développée repose sur le caractère hydrophobe des transporteurs qui permet de les solubiliser dans des mélanges de solvants organiques, comme le chloroforme/méthanol. Cette approche permet l'extraction de protéines hydrophobes et mineures de l'enveloppe, elle est spécifique de la localisation subcellulaire. D'autre part, suivant leur hydrophobicité, les protéines peuvent être extraites de façon différentielle en fonction des rapports de solvants organiques. Les protéines extraites sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes, et analysées par microséquençage. Plusieurs protéines ont été identifiées dont les protéines IE16 et IE18.
Nous avons poursuivi la caractérisation fonctionnelle de IE16 et IE18 en analysant d'une part les homologies de séquences avec des protéines de fonction connue. D'autre part, nous avons obtenu des mutants de cyanobactéries et d'Arabidopsis thaliana dont les gènes correspondant aux protéines IE16 et IE18 ont été interrompus. L'analyse des phénotypes peut fournir des informations sur la fonction des protéines mutées. Notamment, la protéine IE18 pourrait être impliquée dans le transport des ions K+ et/ou H+. Afin d'effectuer des analyses biochimiques sur ces protéines, elles ont été exprimées dans des systèmes hétérologues. Ces protéines sont produites dans le système d'expression cellules d'insecte/baculovirus alors qu'aucune expression n'est détectée dans le système E. coli. Ces protéines forment des homodimères. Les analyses fonctionnelles par électrophysiologie sont en cours actuellement.
Lors des premiers séquençages des protéines extraites dans les solvants organiques, une séquence correspondant à une annexine a été obtenue. Nous avons poursuivi l'étude de cette protéine. Le sulfolipide, lipide spécifique du plaste, est un site à haute affinité permettant l'interaction de l'annexine avec l'enveloppe. L'annexine copurifie avec les chloroplastes et des vésicules d'enveloppe en présence de calcium. Cette protéine ne forme pas de canal ionique lorsqu'elle est insérée dans des bicouches lipidiques planes. Elle ne présente pas non plus d'activité péroxydase. La signification de son interaction avec l'enveloppe du chloroplaste reste à être déterminée.
L'approche que nous avons développée peut être utilisée de façon systématique pour l'étude des transports dans différents systèmes membranaires.
L'approche que nous avons développée repose sur le caractère hydrophobe des transporteurs qui permet de les solubiliser dans des mélanges de solvants organiques, comme le chloroforme/méthanol. Cette approche permet l'extraction de protéines hydrophobes et mineures de l'enveloppe, elle est spécifique de la localisation subcellulaire. D'autre part, suivant leur hydrophobicité, les protéines peuvent être extraites de façon différentielle en fonction des rapports de solvants organiques. Les protéines extraites sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes, et analysées par microséquençage. Plusieurs protéines ont été identifiées dont les protéines IE16 et IE18.
Nous avons poursuivi la caractérisation fonctionnelle de IE16 et IE18 en analysant d'une part les homologies de séquences avec des protéines de fonction connue. D'autre part, nous avons obtenu des mutants de cyanobactéries et d'Arabidopsis thaliana dont les gènes correspondant aux protéines IE16 et IE18 ont été interrompus. L'analyse des phénotypes peut fournir des informations sur la fonction des protéines mutées. Notamment, la protéine IE18 pourrait être impliquée dans le transport des ions K+ et/ou H+. Afin d'effectuer des analyses biochimiques sur ces protéines, elles ont été exprimées dans des systèmes hétérologues. Ces protéines sont produites dans le système d'expression cellules d'insecte/baculovirus alors qu'aucune expression n'est détectée dans le système E. coli. Ces protéines forment des homodimères. Les analyses fonctionnelles par électrophysiologie sont en cours actuellement.
Lors des premiers séquençages des protéines extraites dans les solvants organiques, une séquence correspondant à une annexine a été obtenue. Nous avons poursuivi l'étude de cette protéine. Le sulfolipide, lipide spécifique du plaste, est un site à haute affinité permettant l'interaction de l'annexine avec l'enveloppe. L'annexine copurifie avec les chloroplastes et des vésicules d'enveloppe en présence de calcium. Cette protéine ne forme pas de canal ionique lorsqu'elle est insérée dans des bicouches lipidiques planes. Elle ne présente pas non plus d'activité péroxydase. La signification de son interaction avec l'enveloppe du chloroplaste reste à être déterminée.
L'approche que nous avons développée peut être utilisée de façon systématique pour l'étude des transports dans différents systèmes membranaires.
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